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crispr/cas9 基因敲除，怎样判断grna活性
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利用基因同源重组进行基因敲除
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
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CRISPRCas9精细原理基因敲除点突变基因插入解读
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最佳回答敲除：在外显子上设计gRNA引导cas9切割，造成双链断裂，当缺失的碱基数为3的倍数，修复后可发生移码突变
敲入：gRNA和cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，细胞以外源携带敲入片段的DONOR作为模板进行同源重组修复（HDR），将敲入片段重组到基因组靶点。
点突变：gRNA和cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，细胞以外源携带目标点突变的Donor作为模板进行同源重组修复（HDR），将目标点突变重组到基因组靶位点。
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精准大海捞针--CRISPR screening专题
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最佳回答由于Addgene的篇幅太长，因此决定分为至少两个部分来介绍。
上期： 来自Addgene的CRISPR指南（1）
参考： CRISPR Guide
由于这个部分已经不是简单的看CRISPR guide了，中间还有查阅资料，文献阅读的工作，因此没有再冠以CRISPR Guide的名字。
某天晚上我和师妹在微信上描述CRISPR screening实验时，她表示惊叹说，师姐这难道不是精准的大海捞针吗？因此本期我们的文章标题使用了师妹非常精辟的描述。在平时，我们要研究某基因的功能只能通过单独敲低/敲除、过表达的方式，而CRISPR screening允许我们同时进行上万个这样的操作，一次搞定基因组范围的基因编辑，确可谓：精准大海捞针。
高通量是新时代生物技术的标配，从能一次完成超过5万个基因的PCR（RNA-seq）到细胞谱系追踪（barcoding），在不影响研究精准度的情况下，大大的降低科学研究时间和成本。依据我们前面的介绍，sgRNA将Cas9蛋白靶向至目的序列，Cas9结合到DNA上后剪切DNA，那么以下这几种情况则非常好理解：
（1）Cas9 + 1个sgRNA：针对一个基因进行编辑；
（2）Cas9 + 2个sgRNA：可针对两个基因进行编辑，或者可敲除两个sgRNA之间的大DNA片段；
（3）Cas9 + 多个sgRNA：可同时对多个基因进行编辑；
（4）Cas9 + 上万个sgRNA：同时对上万个基因进行编辑。
针对第3、4种情况，这多个sgRNA的合集被称为CRISPR文库（CRISPR Library），文库的大小可从几十个sgRNA到十几万个sgRNA。文库的出现使得我们可以 同时对上万个基因进行编辑，再筛选出对某特定表型有明显作用的基因集，用于指导下一步研究 ，这一过程称为 CRISPR screening ，举例如下图：
从上图中可以看出，CRISPR Library是包含sgRNA的pool（A-C），并通过慢病毒转导的方式转入Cas9稳定表达或野生型细胞（D），pool sgRNA感染的细胞经过特定特征（耐药性等）区分后，通过NGS测序鉴定与特定特征相关的基因集。除了常规流程的展现，我们还需要注意到 构建pool library的工作量是相当大的 ，如张峰教授组的GeCKO v2 Library可针对19,050个编码基因，而为了提高编辑效率，每个基因都设计了至少6个sgRNA，因此整个library包含有123,411个sgRNA，每个sgRNA都要构建出相应质粒，整个library的构建花费不菲，而我们只需要用500美元即可从Addgene上购得，能够使用这样的工具，真得感谢这些巨人们。
CRISPR Library的类型也根据实验目的、物种、文库大小和投递方式分类，具体信息可以在Addgene网页上可以查看：
在设计CRISPR screening实验之前需要思考以下问题：
（1）CRISPR screening在准备阶段需要使用电转的方式扩增文库，并需要NGS测序来确定文库丰度，尽管目前已经有一些library可以选用化学感受态细胞进行扩增，但选用library之前一定要查阅清楚；
（2）CRISPR screening实验需要大量的细胞，因此对于一些无法扩增、数量有限且非常珍贵的细胞时，如原代细胞等，CRISPR screening则可能不适用；
（3）大多数CRISPR文库需要使用慢病毒将gRNA/Cas9传递到目标细胞。
因此，使用者需要充分考虑课题组的条件是否能达到要求。一旦确定实验条件适合，那么下一步就是选择library， 在选择文库时，也需要考虑以下几点 ：
（1）基因修饰的类型：敲除、激活还是抑制目标基因；
（2）gRNAs的数量：CRISPR Library可以针对整个基因组或某一类特定的基因，例如最近报道的用于增强CRT T细胞在实体瘤中活性的TCR pool knockin CRISPR Library，只有36个目的基因。
（3）物种：特定的CRISPRLibrary中的gRNAs对于特定生物体的基因组是唯一的，并且文库只与来自该生物体的细胞兼容。
（4）library骨架：如骨架中已有Cas9，则直接使用即可；如骨架中无，需要搭配使用Cas9质粒或者要求细胞本身就表达Cas9。
大部分的CRISPR Library都需要使用慢病毒投递系统， 一般有这几种骨架：LentiCRISPR和lentiGuide-Puro（如下图） 等，区别在于前者的骨架中已带有Cas9，因此是一个质粒系统；而后者需要叠加使用一个Cas9质粒。
每个CRISPR文库都是不同的，然而大多数CRISPR文库有几个共同的特性：首先，每个基因文库通常包含3-6个gRNAs，以确保每个靶基因的编辑效果，因此CRISPR文库包含数千个针对多种基因的独特gRNAs；CRISPR文库的gRNA设计通常是优化选择high on-target和low off-target的gRNA；敲除文库通常针对5' 组成性表达的外显子，而激活和抑制文库则针对启动子或增强子区域。
虽然含有Cas9的慢病毒文库是目前最流行的CRISPR筛选方法，但它们并不适用于所有的细胞类型或实验。AAV骨架的哺乳动物CRISPR文库主要用于体内实验，逆转录病毒形式的文库可用于慢病毒转导效率差的细胞中。此外，由于技术问题，CRISPR在细菌中的应用较少，但仍有几个细菌CRISPR文库通过dCas9作用达到抑制效果。
在文章TSC1 and DEPDC5 regulate HIV-1 latency through the mTOR signaling pathway 中，作者为探讨调控HIV病毒潜伏的关键基因，作者首先构建HIV的荧光报告细胞（HIV-1 proviral DNA+GFP），当HIV病毒复制的时候，GFP也同时表达，因此可以通过绿色荧光来观测HIV病毒的活动情况。
在HIV-GFP报告细胞中，转入sgRNA library进行大规模基因敲除，一定时间后用FACS分选出强绿色荧光表达细胞，经过4个循环后则得到了低荧光（HIV潜伏）和高荧光（HIV活动）两组细胞，通过NGS测序发现两组细胞中的sgRNA丰度情况，经过3次重复后得到257个基因对HIV病毒活动有正向作用，最后通过数据分析筛选出TOP的gene集。后续可针对TOP基因集进行针对性的验证。
通过这个例子，我们还可以想象，把GFP细胞换成肿瘤药耐药细胞如厄洛替尼，将FACS分选换成给药+不给药两组，一定时间后检测两组细胞的sgRNA丰度差别，则可以找到厄洛替尼耐药相关的基因。
（1）需要注意骨架中的启动子是否适合自己的目的细胞，例如CMV启动子非常广谱，但对于人胚胎干细胞的效率则非常低，需要选用带有EF1α启动子的骨架。
（2）部分library要求细胞本身就表达Cas9，这本无可厚非，但部分细胞在高表达Cas9的情况下非常脆弱，这时候需要考虑使用inducible Cas9 system，而这个系统的构建本身就是有难度的实验，因此在设计可提前一定要做好全面分析。
（3）Library扩增工作量非常大，需要尽可能的严格按照protocol进行，并且配备质粒超大提试剂盒，部分Library要求使用特殊的感受态细胞，而该细胞之外国外出售并且非常贵。
（4）由于Library非常庞大，慢病毒的包被也是大批量的，如果使用Lipo3000或者Roche的转染试剂则花费非常大，此时可以考虑使用PEI40000等便宜且效果又好的转染试剂。
（5）此外，慢病毒的包被需要选择状态好且代数低的293T细胞，如果有293FT细胞则效果更佳。
（6）考虑筛选标记的冲突，例如目的细胞是通过慢病毒转染的方法稳定表达Cas9，且筛选标记是puromycin，那么几乎所有的Library的抗性筛选基因都是puromycin，这就冲突了。
具体更多的细节还需要我们去发现。
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基因编辑治疗艾滋病的根本原理是什么？
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最佳回答CRISPR/Cas9系统作为编辑HIV-1病毒基因组获取了一种全新的有潜力的工具。近日源自日本神户大学医学院传染疾病中心以及保健科学研究生院国际卫生系的研究人员设计师了一种RNA引领的CRISPR/Cas9以此靶向HIV-1调节基因tat与rev，其中的引导RNAs（gRNA）均根据CRISPR的特异性设计，其靶向的序列于6种主要的HIV-1亚型之中均激进存在。
于共计转染后每个gRNA均遭复制人进CRISPRv2快病毒之中，进而开创了快病毒载体并且把之介导转入细胞。与没转染及转染空载体的细胞相对，CRISPR/Cas9转染平稳表达Tat与Rev的293T与HeLa细胞之后，细胞之中的这两个基因表达均遭顺利的抑制。
功能试验表明转染tat-CRISPR明显刺激了HIV-1启动子液压的荧光素酶的表达，因而Dr功能试验亦表明转染rev-CRISPR之后gp120的表达遭全然刺激。Cas9剪切位点的靶基因发生高频的各种程度的突变。值得注意的是，研究人员没侦测到任何非靶标靶位点发生突变，除此之外Cas9的表达对于细胞的活性没影响。
研究人员更进一步于HIV-1传染的T细胞系之中试验了他们的CRISPR/Cas9系统，结论找到即使展开细胞因子再次抑制，p24的表达亦遭明显刺激，因而除此之外采用6种gRNAs可更进一步减弱编辑效率。所以透过CRISPR/Cas9系统靶往HIV-1调节基因或许是一种构建功能性医治的精确方法。
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CRISPR/Cas9指南
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最佳回答成簇规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，即 CRISPR ）II型系统是细菌免疫系统，现已被改造用于基因工程。在CRISPR/Cas9广泛应用之前，像锌指核酸酶（ZFNs）或转录激活因子类效应核酸酶（TALENs）等基因工程技术，都需要使用定制的DNA结合蛋白核酸酶，这需要科学家为每个基因靶标设计和生产新的核酸酶对(nuclease-pair)。（相比而言，）CRISPR主要因其简单性和适应性，已迅速成为基因工程中最受欢迎的方法之一。
CRISPR包括两个部分：一个向导RNA( gRNA )和一个非特异性CRISPR结合核酸内切酶(CRISPR-associated endonumclease即 Cas9 )。向导RNA是一个短的合成RNA,由一段结合Cas9必需的scaffold序列和特定的约20nt的空载(spacer)或靶向(targeting)序列（靶位点）组成，其中靶向序列决定了用于修饰的基因靶标。因此我们只需改变gRNA上的靶向序列即可改变Cas9的基因靶标。CRISPR最初用于敲除各种细胞类型或生物体的靶向基因，但对Cas9酶的改造已经将CRISPR的应用扩展到选择性激活或抑制靶向基因或纯化特定的DNA区域，甚至可以和荧光显微结合用于展现活细胞中的DNA。而且，产生gRNAs的便捷促使CRISPR成为了最具扩展性的基因编辑技术之一，近来已被应用于基因组水平的筛查。
这篇指南将提供CRISPR/Cas9生物学方面的概览，介绍CRISPR的不同应用诸位在各自领域上开展CRISPR/Cas9的研究。
通过靶向基因特异的gRNA和核酸内切酶Cas9的共表达，CRSIPR/Cas9可用于产生敲除细胞或敲除动物。** 基因靶位点可以是任何满足以下两点条件的约20nt的DNA序列：**
PAM序列是结合靶标必不可少的，具体序列取决于Cas9的种类（酿脓链球菌Cas9 5’NGG3’）。我们将关注酿脓链球菌Cas9，因其目前广泛使用于基因工程。一旦表达，Cas9蛋白和gRNA将形成一个核糖体蛋白复合物，这个复合物是通过gRNA的scaffold区域和Cas9上表面暴露带正电荷的沟糟相互作用形成的。Cas9与gRNA的结合后构象发生了改变，分子由无活性的非DNA结合构象转变为有活性的DNA结合构象。更重要的是gRNA上的靶位点序列仍未和靶标DNA发生相互作用。Cas9-gRNA复合体将任意地结合基因组上的PAM序列，但是只有gRNA靶位点序列与靶标DNA配对时，Cas9才能进行切割（这段靶标DNA）。一旦Cas9-gRNA复合物结合到一段认定的DNA靶标，在gRNA靶向序列3’端的“种子”序列开始使靶标DNA退火。如果种子序列与靶标DNA序列配对，gRNA将持续的沿3’到5’端方向使靶标DNA退火。
只有当gRNA靶位点序列与靶基因有足够的同源性存在时，Cas9才会作用切割靶基因。拉链式的退火机制可能解释了为什么靶标上3’端种子序列上的错配会完全破坏对靶标的切割，而5’端的错配有可能会对靶标进行切割。Cas9核酸酶有两个功能性内切酶区：RuvC和HNH。当Cas9与靶基因位点结合时发生了第二次构象变化，核酸酶功能区对靶标DNA的反向链进行定位切割。Cas9介导的DNA切割最后结果是目标DNA（PAM序列上游约3～4nt）的双链断裂（double strand break，DSB）。
双链断裂后由以下两种常规的修复途径进行修复：
NHEJ修复途径是最活跃的修复机制，能快速的修复双链断裂，但通常会在双链断裂位点产生小的插入缺失。NHEJ介导的双链断裂修复的随机性具有重要的实用意义，因为Cas9和gRNA在细胞群体中的表达，将产生多种不同的突变。大多数情况下，NHEJ引起的靶标DNA上的小InDels，会导致阅读框内的氨基酸插入缺失，或者移码突变引起的目标基因上ORF提前终止。理想情况下，在靶标基因内形成功能缺失性的突变。然而，对特定的突变细胞表型的敲除能力最终取决于残存的基因功能的剂量。
当gRNAs设计准确时，CRISPR/Cas9具有很高的特异性，但是特异性依然是一个主要的关注点，特别是当CRISPR应用于临床时。CRISPR系统的特异性主要取决于gRNA靶向序列特异性如何，即基因靶标相比于基因组其余部分的情况。理想状态下，gRNA靶向序列与靶标DNA具有高度同源，而与基因组上其它位置没有同源性。（但）现实是，在基因组上，会有另外的位点与指定的gRNA靶向序列部分同源。这些位点被称为“脱靶”，你在设计gRNA时需要考虑到这些位点。
为了优化gRNA的设计，CRISPR的特异性可以通过改造Cas9自身来得到提升。如先前讨论那样，Cas9通过两个核酸酶功能区域，RuvC和HNH，的结合活性来形成双链断裂。每个核酸酶结构域上精确的氨基酸残基是已知的，这些残基序列对内切酶的活性至关重要（在酿脓链球菌Cas9中D10A对HNH和H840A对RuvC），Cas9酶的修正版已生成，它仅包含一个催化活性功能域(称为“Cas9 nickase”)。Cas9切口酶依然基于gRNA的特异性来结合DNA,但切口酶仅能切开DNA的一条链，形成一个切口“nick”,或使单链断开，而不是双链断裂。使用完好的互补链作为模板，DNA上的切口迅速地被HDR途径（同源性修复途径）修复。因此需要使用两个切口酶来切割靶标DNA的两条链以形成双链断裂（这种通常被称为“double nick”或者“dual nickase”CRISPR系统）。这种需求迅猛地增加了靶特异性，因为这和在足够近的范围内双链断裂产生的两个脱靶的nicks的方式截然不同。因此，如果特异性或者减少脱靶的影响是考虑的关键因素，那么就采用双切口酶方法来产生两个nick引起的双链断裂。为了获得高特异性的基因编辑，切口酶系统也可以联合HDR（同源性修复途径）介导的基因编辑一起使用。
NHEJ介导的双链断裂修复不够完美，通常会导致基因ORF阅读框的中断，HDR能用于产生特异性的核苷酸改变（这也是人们所说的基因“编辑”），这种改变小到单核苷酸改变大到大片段插入（例如，添加一个荧光基团或者tag）。
为了利用HDR进行基因编辑，一段DNA”修复模板”序列需要和gRNA+Cas9蛋白／Cas9n蛋白一同转入研究者感兴趣的细胞中。修复模板必须包含所需编辑位点以及紧邻靶标的上下游同源序列（称作左右同源臂）。每条同源臂的长度以及结合位点取决于想要进行的改变的大小。修复模板可以是一个单链寡核苷酸/双链寡核苷酸/双链DNA质粒，这因不同的应用而不同。值得一提的是，修复模板在基因组DNA不能带有PAM序列，否则修复模板将成为Cas9切割的合适目标。例如，PAM序列可以进行突变处理，以至于不再出现，但是基因编码区不受影响（也即，沉默突变）
即使在表达Cas9、gRNA和外源性修复模板的细胞中，HDR效率通常也比较低（低于修饰等位基因的10%）。因此，一些实验室人为地尝试加强HDR，有的是在HDR起作用时同步化细胞周期，有的是通过化学的或遗传学的抑制基因来参与NHEJ。HDR的低效性有许多重要的实用意义。首先，因为Cas9的切割效率相对较高，而HDR效率相对较低，一部分Cas9引导的双链断裂被NHEJ修复。也就是说，最后细胞群体中会包含一些野生型等位基因，NHEJ修复的等位基因，和/或一些所需的HDR编辑等位基因。因此，需要通过实验来验证所需的编辑是否存在，如必要的话，对所需编辑的克隆进行分离。
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