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引物设计原则是什么?
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贡献者回答引物设计的原则是：
1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
2、引物长度一般在15-30碱基之间。
3、引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。
4、引物3′端要避开密码子的第3位。
5、引物3′端不能选择A，最好选择T。
6、碱基要随机分布。
7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。
8、引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。
9、引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
10、扩增产物的单链不能形成二级结构。
11、引物应具有特异性。
常用引物设计软件
1、Oligo 6
Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件，除了可以简单快捷地完成各种引物和探针的设计与分析外，还具有很多其他同类软件所不具有的高级功能：已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列；按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物；对环型DNA片段，设计反向PCR引物；设计多重PCR引物。
2、Primer Premier 5.0
Primer Premier 5.0是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb的PCR产物的引物序列。
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多重pcr引物设计应注意哪些问题
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贡献者回答设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，
被扩增的靶序列适宜的酶切位点，
这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
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多重pcr引物设计的原理有哪些
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贡献者回答1、多杀性巴氏杆菌的Km t 及toxA 基因 T +Pm具有Km t 及toxA 基因 T Pm具有Km t基因 PCR引物：
P1: 5′- A TC CGC TA T TTA CCC A GT GG-3′ P2: 5′-GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC-3′ P3: 5′- CTT A GA TGA GCG ACA A GG-3′ P4: 5′- GAA TGC CAC ACC TCT A TA G-3′ 引物P1，P2检测Pm,扩增片段为457bp; 引物P3，P3检测T +Pm，扩增片段为864bp.
退火温度56℃，时间30秒
2、禽多杀性巴氏杆菌基因序列（U51470） 引物：
上游引物：5’-TGC CAA AGT TGC CAA TAC TCC-3’ 下游引物：5’-TCC CGT CCT CAT TTC TTG CG-3’
退火温度45℃，时间1分钟
3、猪巴氏杆菌
参考GenBank中猪巴氏杆菌序列设计引物
上游PAS1：5’-AgggCACgCAggCggACTTTTA-3’ 上游PAS2：5’-ATCgACAgCgTTTACAgCgTggA-3’
退火温度56.5℃，时间1分钟
4、致病性嗜水气单胞菌（ 嗜水气单胞菌标准株Ah10501）
究针对GenBank 中登录的致病性嗜水气单胞菌的溶血素基因( hlyA ) 、气溶素基因( aerA ) 以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA 保守区设计了3 对特异性引，非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA 和aerA ,而致病性分离株则至少含有hlyA 基因
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多重PCR技术知多少
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敏感性可以从两方面分析：Analytical Sensitivity （检测敏感性）和Clinical Sensitivity （临床敏感性）。
Analytical Sensitivity (AS)强调的是检测结果：如果标本中含有被检测物，检测成功的几率是多少。如果是PCR反应，就是能检测到的最低拷贝数。一个能检测到一个拷贝病原体的test，显然要比一个需要一万个拷贝才能给出阳性结果的检测敏感性高。
Clinical Sensitivity(CS)是从临床角度看问题：实验结果给病人出诊断的成功率有多高。
如果一个病仅有一个病因，检测敏感性和临床敏感性无差别。如果疾病的诊断需要同时分析多病因，仅对一个指标进行检测，检测敏感性再高其临床敏感性也要大打折扣。qPCR 的检测敏感性是无可争议的，可是因为无法做多重，所以临床敏感性不够好。多重PCR临床敏感性要高很多。
多重PCR有着重要的临床意义和广泛的应用前景，但是仍然存在很多限制性因素，其中多重PCR扩增效率的一致性一直是最大的难题，扩增子越多、不均一性越高等。针对多重PCR存在的问题，市面上多家生物研发公司均有着自己的应对策略，各有优势。据笔者了解，目前上海翼和生物利用自主研发的多重PCR引物设计软件结合知识密集型的多重PCR优化技术服务，并且采用独有的引物基团修饰技术，使得数百个扩增子片段，均能被有效扩增在引物上完成化学基团的修饰后，引物之间无法随机匹配，引物所带的修饰基团能隔离开其他引物，因此更多的引物都可以在单管PCR体系中完成，并且修饰基团在热变性后会消失。并且在建库过程中引物端自动加上样本区分barcode，无需二次建库。
翼和生物技术顾问肖君华博士介绍，该公司的多重PCR技术，均一性高，90%扩增子达到15个reads；特异性高，90%的靶序列均能被有效扩增，结合该技术的建库试剂盒适用于当前各类高通量测序仪器的富集文库构建，包括PGM，Miseq，Hiseq各类机型和试剂盒。"我们的多重PCR技术已使用于基于高通量平台的各类技术服务，如目标序列重测序，高通量SNP检测服务，高通量微卫星（STR/SSR）检测服务。"
引物设计图
在后基因组时代，对基因组候选区段的重测序需求日益增加，人们对序列的关注超过了少数的SNP，候选区段的范围可能在5Kb-100Kb之间，使用传统sanger法或目标区域杂交捕获测序价格昂贵，使用多重PCR目标区域捕获测序很好的解决了这一难题。通过多重PCR对扩增整个基因区域，一次性捕获，结合高通量测序技术，多样本同时测序，在大样本量筛查的同时极大的降低成本。本方法适用于孟德尔遗传性疾病的筛查和诊断、GWAS候选区段重测序、QTL定位区段重测序、精准医疗研究与应用。
高通量SNP检测服务结合多重PCR和高通量测序技术，对需要检测的位点设计特异性引物，在单管内进行多重PCR扩增，不同的样本以不同的barcode引物区分。混合样本后，在测序平台上，对扩增子进行测序，测序结果使用生物信息学方法，区分不同样本，最终获得每个位点的SNP信息。本方法适用于不同目的遗传学研究，例如疾病基因组研究，肿瘤基因组研究，疾病与基因的关联研究，临床分子诊断等，在植物基因组研究中，可用于QTL定位及分子育种，非常适合大规模样本的SNP分析。
针对价格问题，肖博士表示，目前市面上，靶向序列多重PCR产品多采用LM-PCR技术，及连接介导（ligation-mediated PCR）多重PCR建库试剂盒，通过市场调查，LM-PCR建库时，建库成本在300-400元/样品，而翼和生物的多重PCR建库成本在100元/样本。
多重PCR不仅仅是为了增加效率或者降低费用，更重要的是没有多重，分子诊断的临床意义就不大，应用就不够广泛。
临床应用中，翼和生物还发挥了更多的作用，开发包括化疗药物疗效和毒副作用相关位点检测、乙肝病毒分型及YMDD突变检测、华法林相关SNP检测和氯匹格雷相关SNP检测的产品等。此外还研发改良了多种分子遗传学技术服务手段，最具代表性的服务平台包括低中高通量单核苷酸多态性（SNP）检测，中高通量微卫星（STR/SSR）检测，二代多重PCR扩增子建库，二代靶向重测序，拷贝数变异多样性（CNV）检测，实验小鼠遗传背景鉴定，细胞鉴定多种基因表达定量（MCF）检测，microRNA检测等平台。
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