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CRISPR简述

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贡献者回答（1）锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)：是第一代人工核酸内切酶

（2）类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)：第二代人工核酸酶。

（3）Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 第三代人工核酸内切酶（前两代就是ZFN和TAILEN）。

（4）人工核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)

Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier重在CRISPR/Cas9技术的基础研究，而张峰和George Church在各种人类细胞中的应用方面贡献较多，其中张锋对CRISPR/Cas9技术方面的改进也有突出的贡献。

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR） ：是在细菌中发现的有规律成簇又带间隔的短回文序列，可以帮助细菌抵抗噬菌体的入侵，是细菌针对噬菌体的获得性免疫。 CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统 。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。

CRISPR locus是由几个原件构成，如下图：一开始是个反向转录的RNA，是特异的非编码RNA，可以和重复序列部分互补（trancrRNA，橙色矩形），后面是各种cas基因（箭头表示），接着是CRISPR排列（棕色的菱形是重复序列，彩色的是间隔）。而这些间隔序列是细菌从噬菌体DNA中获得的遗传序列：当噬菌体感染细菌，细菌激活相关的cas基因——Cas1，Cas2,和Csn2，将其中新的间隔序列整合到自身的CRISPR arry中。一旦获得新的间隔序列以后，新的spacer就会出现在pre-crRNA中，此时tracrRNA与不同的SPACER互补，在RNaseIII的作用下，产生crRNA，进一步在其他未知的核酸酶的作用，剪切crRNA的5'端， 使得引导序列长为20nt 。如果噬菌体注入DNA，那么这个免疫系统将被激活，来干扰剪切噬菌体DNA，起到获得性免疫作用。

经过广谱检测，人们发现了三种主要的CRISPR系统，它们由CRISPR-associated (Cas)基因、非编码rna和一组独特的重复元素(直接重复)组成，而这些重复序列则由来自外源性DNA靶点(即原间隔体)的短可变序列直接间隔开来；重复序列+间隔序列=CRISPR RNA (crRNA) array。在有DNA靶点的情况下，每一个间隔序列都有一个前间区序列邻近基序（PAM——Ⅱ型系统的PAM基序为 5-NGG-3 ）。

II型CRISPR系统是最具特征的系统之一，它由核酸酶Cas9、编码引导rna的crRNA阵列和有助于将crRNA阵列加工成离散单元的所需辅助反式激活crRNA (tracrRNA)组成

S. pyogenes亚型II-A Cas9(1368个氨基酸)是基因组工程中研究最多、使用最多的Cas9版本。其优势是：氨基酸序列相对较小，方便操作，且只是需要一个DNA内切酶Cas9来对与sgRNA20个互补碱基的带有PAM结构的DNA进行剪切。剪切后是DNA产生平末端的DSB（双链断裂），然后在进行非同源的末端连接(NHEJ)过程中，容易随机插入或者删除或者替换。或者进行高保真的同源定向修复(HDR)，修复DNA。

CRISPR RNA (crRNA) array，编码gRNA，再加上tracrRNA，则可达到定位+编辑的功能 ，gRNA用于引导，tracrRNA用于结合靶点。把crRNA和tracrRNA合在一起，成为了single-guide RNA，即 sgRNA ，而通过修改tracrRNA的序列，在理论上可以on-target任何目的靶点。

这项技术主要由sgRNA定位到一个基因位点上，由Cas9酶在该位点进行DNA双链的切割，切割导致DNA修复通路的激活，使得其它的碱基加入进切割的位点，造成frameshift突变，使得基因无法被表达成功能性蛋白。

Cas9造成基因不被表达是由NHEJ修复通路引起，然而，Cas9造成的DSB并不一定会引发NHEJ，因为DSB end的碱基并没有任何损坏，这种end也叫blunt end，很容易再次粘连在一起，此时可以通过外源性同源重组引入Gene drive，或者说blunt end再次粘连在一起，sgRNA也会会再次识别这段序列，然后Cas9会再次切，反复下去，直到发生了由NHEJ引导出的突变，sgRNA才不会识别这段序列。

CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成 。

①前导序列 ：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游， 被认为是CRISPR序列的启动子 。

②重复序列 ：长度约20–50 bp碱基且包含5–7 bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构， 稳定RNA的整体二级结构 。

③间隔序列 ： 是被细菌俘获的外源DNA序列 。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。

化脓性链球菌

Cas9（以下称为SpyCas9）是大型（1,368个氨基酸）多结构域和多功能DNA核酸内切酶。它通过其两个不同的核酸酶结构域在PAM上游剪接dsDNA 3 bp：一个HNH样核酸酶结构域，其切割与指导RNA序列互补的DNA链（靶链），以及一个RuvC样核酸酶结构域，其负责切割DNA。与互补链相反的链（非目标链）。除了在CRISPR干扰中起关键作用外，Cas9还参与crRNA成熟和间隔区获取。

先简单介绍一下张锋实验室的CRISPR DOUBLE NICKASE

和普通Cas9不同的是，Cas9n (Cas9 Nickase)上有一个D10A的氨基酸突变，这个突变使得Cas9不再导致DNA双链断裂和NHEJ修复（一种会引来突变的修复），而是会引起单链断裂和BER修复（一种不会引起突变的修复），如下图

利用Cas9 nickase只能进行单链剪切的特性，张峰团队想到把两个Cas9 nickase共同作用在一个基因位点上，使其形成双链断裂（DSB），而非特异性结合则不会引起DSB，这样就降低了非特异性突变。

Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的 非同源末端连接 方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（ 移码突变 ：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除

当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行 同源重组修复 （HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率

Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。

将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。

利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。

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CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（7）验证敲除--WB

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贡献者回答 先确定目标基因

CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（1）

然后对目的基因进行背景调查

CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（2）磨刀不误砍柴工

设计sgRNA及引物

CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后

CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（3）sgRNA及引物设计

CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（4）构建sgRNA+Cas9载体

转染验证

CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（5）293FT细胞转染验证 and trouble shooting

CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（6）正式转染+单克隆细胞筛选

以下是我的基本流程：

不是没有在验证表达上吃过亏，上次吃亏我已经吸取到教训，在WB验证之前，仔细查阅了同样的细胞系的该蛋白的表达情况，并且在RNA-seq数据中也发现了是有一定表达量的，至少有PNAS，NC级别的文章验证过该蛋白在该细胞中的表达，并且不需要任何预先处理，所以放心的去做了WB。但是打脸真的是啪啪的。首先，每个课题组的情况都不一样，其次，所用的试剂耗材未必相同，接着预处理未必一样，还有就是别人的结果我们不一定能重复出来，因此在遇到蛋白水平无法检测的时候该怎么办。

说干就干。

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如何设计我的CRISPR/Cas实验

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贡献者回答十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为 CRISPR 结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR 方法已迅速席卷了整个动物王国，成为 DNA 突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用 CRISPR 分析了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系）。就在最近，CRISPR 还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（gene disruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过（详细报道 Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。

CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达 CRISPR 相关酶，也就是 Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。

将 CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个 Cas 酶，用于切断靶标 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一个就是称为导向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA 也就是细菌细胞中 CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与 Cas 形成复合物，指导 Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变 Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。

“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中 CRISPR 的作用机制。近期，Doudna 研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。

不过 CRISPR 技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些 gRNA 分子结合的 DNA 只是部分与 gRN 互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比 gRNA 难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的 TALENS，以及几十个不同的 ZFNs，来证明其中一个有效。

近期《科学家》（The Scientist）杂志汇总了基因编辑过程中 Cas 和 gRNA 的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。

如何 CRISPR 我的靶标？

由于 CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达 Cas 和 gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一种 Cas 的变体，即 Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由 RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切断与 gRNA 结合的 DNA 链，也能切断其互补链。目前可以从 Addgene 购买 Cas9 质粒（65 美元），将其直接转染入细胞。

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dCas9技术流程与实验问题解决方案

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贡献者回答1设计sgRNA

按照“20N+NGG(PAM)”的设计原理设计sgRNA，至少设计3条。

2构建sgRNA和dCas9-target 质粒

3、构建dCas9-target稳转株

稳转株蛋白构建完成后，用flag抗体或目的蛋白抗体检测稳转株是否构建成功，如果载体上有荧光蛋白，可用荧光检测细胞株是否构建成功。

4、Flag-ChIP-QPCR验证sgRNA的工作效率

1怎样避免sgRNA脱靶

脱靶效应与sgRNA的精确设计有着密切的关系，一般的sgRNA设计网站都会给出设计序列相应的脱靶位点、GC含量或综合得分。

我们一定要选择综合得分高和脱靶位点少的sgRNA序列，且一般至少设计3条sgRNA。

2怎样选择CRISPR系统？

如果要靶标多个基因位点，建议您选择CRISPR-cpf1系统，这个系统的sgRNA只有40多bp，比普通Cas9蛋白的sgRNA要小一半，一个sgRNA载体可同时插入多个sgRNA。

如果要更精确的编译基因组，建议选择Cas9 nicknase，这个蛋白是Cas9的突变体，只切割DNA的一条链，因此，这个系统需要设计两个sgRNA，同时切割，才能产生DNA双链缺口。同时，这种方法大大降低了脱靶效应。

3 Cas9的单切系统和双切系统是什么？

Cas9的双切系统是未突变的Cas9内切酶，Cas9内切酶可以切割双链DNA。Cas9

的单切系统使用的是单突变Cas9内切酶，即Cas9 Nicknase，Cas9 Nicknase需要两套才可以切割双链DNA。

4 怎样选择CRISPR系统的质粒？

 如果您的细胞的转染效率较高，可使用普通载体，如果您的细胞不容易转染，建议使用腺病毒或慢病毒载体。

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